پس از 25 روز انکوباسیون ایستا در دمای 28 درجه سانتیگراد، لاکاز از *Pleurotus ostreatus* NRC620 بالاترین فعالیت را در محیط کشت قارچ نشان داد. مقادیر بهینه pH و دما برای این آنزیم به ترتیب 3.0 و 70 درجه سانتیگراد بود. پس از 2 ساعت انکوباسیون در دمای 40 درجه سانتیگراد و 50 درجه سانتیگراد، فعالیت آنزیم به ترتیب 68.33٪ و 59.61٪ حفظ شد. پس از 2 ساعت انکوباسیون در بافر سیترات-فسفات (pH 7.0)، فعالیت آنزیم در 100٪ باقی ماند. افزودن 10 میلیمولار MgSO₄ و CuSO₄ فعالیت آنزیم را به ترتیب تقریباً 21٪ و 35٪ افزایش داد، در حالی که NaCl، MnCl₂، KCl و CaCl₂ فعالیت آنزیم را مهار کردند. با استفاده از ABTS به عنوان سوبسترا، پارامترهای سینتیکی (Km و Vmax) لاکاز *Pleurotus ostreatus* NRC 620 به ترتیب 1.99 میلیمولار و 16217 میکرومول در دقیقه-1 لیتر-1 بودند. تیمار آنزیمی نمونههای آب سیب به طور قابل توجهی pH و ویسکوزیته را کاهش داد و این کاهش با افزایش زمان نگهداری همبستگی داشت. تیمار لاکاز منجر به کاهش جزئی در محتوای فنلی کل آب سیب شد، اما هیچ کاهشی در فعالیت آنتیاکسیدانی مشاهده نشد.
در سالهای اخیر، محققان بر کاربرد بیوتکنولوژی سبز در صنایع غذایی تمرکز کردهاند. لاکاز یکی از مفیدترین آنزیمها در صنایع غذایی است که کاربردهایی در زمینههایی مانند فرآوری آبمیوه، پخت، تثبیت شراب و بهبود کیفیت ارگانولپتیک محصولات غذایی دارد.1بسیاری از گیاهان عالی و میکروارگانیسمها لاکاز ترشح میکنند،2و قارچهایی مانند دئوترومیستها، آسکومیستها و بازیدیومیستها نیز میتوانند لاکاز تولید کنند.3لاکاز (EC 1.10.3.2) یک اکسیداز آبی است که با استفاده از سیستمی متشکل از سه اتم مس مختلف، اکسیژن مولکولی را به آب احیا میکند و در نتیجه ترکیبات فنلی مختلف و آمینهای آروماتیک را اکسید میکند. در طول تولید آب میوه و سبزیجات، قهوهای شدن آنزیمی و غیرآنزیمی از مسائل حیاتی هستند.4از آنجایی که این مواد بر رنگ، طعم و عطر آبمیوه تأثیر منفی میگذارند، باید از بین بروند.5
از بین تمام میوهها، سیب بیشترین مصرف را در سراسر جهان و در اتحادیه اروپا دارد. در سال ۲۰۱۹، تولید سیب با بیش از ۸۷ میلیون تن در رتبه سوم جهان قرار گرفت.6سیب حاوی ترکیبات فنلی متعددی از جمله فلاونوئیدها و اسیدهای فنلی مانند اسید کافئیک و اسید کلروژنیک است.7از آنجا که آب سیب معمولاً به شکل شفاف مصرف میشود، تقریباً ۵۰ تا ۹۰ درصد از اجزای فنلی آن در طی فرآیند فیلتراسیون از بین میرود.8امروزه، مصرفکنندگان تمایل دارند محصولاتی با حداقل فرآوری، مانند آب سیب کدر با محتوای پلیفنول بالا، را انتخاب کنند. با این حال، به دلیل محتوای فنلی بالا، این نوع آب سیب به ویژه مستعد تغییر رنگ و تیره شدن است.9فناوریهای مختلفی، از جمله روشهای عملیات حرارتی مانند پاستوریزاسیون در دمای ۶۰ تا ۹۰ درجه سانتیگراد، برای کاهش یا جلوگیری از تیره شدن آب سیب استفاده میشوند.10با این حال، طبق تحقیقات Sauceda-Gálvez11، پردازش حرارتی میتواند مواد شیمیایی فرار را از بین ببرد و بر کیفیت ارگانولپتیک آب سیب تأثیر بگذارد. جایگزینهای روشهای پردازش حرارتی شامل دی اکسید کربن فوق بحرانی، تابش فرابنفش، فراصوت، فشار هیدرواستاتیک بالا یا همگنسازی با فشار بالا است.12کارایی این فناوریها و میزان تولید آبمیوه مناسب به پارامترهای مورد استفاده و ویژگیهای محصول بستگی دارد. استفاده گسترده از آنها به دلیل هزینههای بالا، اثرات نامطلوب بر کیفیت برخی از محصولات غذایی یا غیرفعالسازی ناکافی آنزیم محدود شده است.۱۳،۱۴
لاکاز میتواند برای تثبیت و شفافسازی آبمیوه استفاده شود.15گوکمن و همکاران16استفاده از لاکاز را برای شفافسازی آبمیوه توصیه میکنیم زیرا این ماده با تبدیل ترکیبات فنلی به پلیمرها یا الیگومرهایی که به راحتی توسط هر غشای اولترافیلتراسیون حذف میشوند، به طور مؤثر آنها را حذف میکند و به آب سیب اجازه میدهد تا رنگ و شفافیت پایدار را تا شش هفته در دمای 50 درجه سانتیگراد حفظ کند. لاکاز خالص *Trichoderma* روی مهرههای آلومینا تثبیت شد و برای حذف انتخابی ترکیبات بدطعم ناشی از آلودگی میکروبی آب سیب استفاده شد.17
تقریباً ۸۰ تا ۹۰ درصد از اجزای فرار آب سیب، استرها و آلدهیدها هستند که عطر و طعم بینظیری به آب سیب میدهند.18لاکاز از *ترامتس ورسیکالر* برای شفافسازی آب سیب، روی یک پایه ارزانقیمت ساخته شده از فیبر طبیعی پوسته نارگیل جوان تثبیت شد.19مطالعات قبلی، تثبیت آب سیب (رنگ و کدورت) را با استفاده از روشهای بدون آنزیم یا بیحرکتسازی یا در ترکیب با اولترافیلتراسیون بررسی کردهاند.۵،۱۹با این حال، تأثیر لاکازهای قارچی بر خواص فیزیکوشیمیایی آب سیب در طول نگهداری هنوز مشخص نیست. بنابراین، هدف از این مطالعه بررسی تجربی تغییرات در خواص فیزیکوشیمیایی، محتوای ترکیبات فنلی و فعالیت آنتیاکسیدانی آب سیب پس از تیمار با لاکازهای قارچی و نگهداری دو هفتهای در یخچال بود. لاکازها توانایی اکسیداسیون ترکیبات فنلی را دارند که آنها را برای استفاده در فرآیندهای مختلف صنعتی، از جمله شفافسازی آبمیوه، امیدوارکننده میکند. این مطالعه لاکازهای *Pleurotus ostreatus* NRC 620 را بررسی کرد و بر شرایط ایدهآل برای فعالیت و اثربخشی آنها در شفافسازی آبمیوه تمرکز داشت. در حالی که تحقیقات در مورد قارچهای صدفی (P. ostreatus NRC 620) هنوز محدود است، مطالعات قبلی آنزیمهای منابع قارچی مختلف، مانند Trametes versicolor و Ganoderma lucidum را بررسی کردهاند. هدف از این مطالعه ارزیابی کاربرد بالقوه این آنزیم در صنعت غذا و برجسته کردن خواص منحصر به فرد آن، به ویژه pH و دمای ایدهآل آن بود.
۲،۲′-آزوکسیبیس (۳-اتیلبنزوتیازولین-۶-سولفونیک اسید) (ABTS) از شرکت سیگما-آلدریچ (کانادا) خریداری شد. سایر معرفها دارای درجه خلوص تحلیلی بودند.
مرکز جمعآوری کشت میکروبی مرکز تحقیقات ملی، سویه شناختهشده قارچ صدفی NRC620 را به دست آورد. پس از کشت مجدد، این سویه روی محیطهای کشت شیبدار سیبزمینی دکستروز آگار در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شد. روش تهیه تلقیح به شرح زیر بود: میسلیومهای ۱۰ روزه و کاملاً توسعهیافته روی پلیتهای سیبزمینی دکستروز آگار تلقیح و در دمای ۲۸ درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از ۱۰ روز، سه بلوک میسلیومی به قطر ۱۲ میلیمتر با استفاده از پانچ فلزی استریل از محیط کشت آگار خارج شده و در ارلنمایرهای ۲۵۰ میلیلیتری با درپوشهای پنبهای حاوی ۵۰ میلیلیتر محیط کشت استریل (pH 5.0، همانطور که قبلاً توسط عثمان و همکاران توضیح داده شده است) قرار داده شدند.20). کشتها به مدت ۱۸ روز در دمای ۲۸ درجه سانتیگراد انکوبه شدند. سپس کشتها از طریق کاغذ صافی واتمن شماره ۱ فیلتر شدند و محلول رویی حاصل به عنوان منبع آنزیم در نظر گرفته شد.
فعالیت لاکاز با استفاده از ABTS به عنوان سوبسترا تعیین شد. مخلوط واکنش (2 میلیلیتر) حاوی 500 میکرولیتر ABTS 0.3 میلیمولار (حل شده در بافر سیترات سدیم 0.1 مولار، pH 4.5) و مقدار مورد نیاز نمونه آنزیم رقیق شده با آب مقطر بود.۲۱،۲۲با توجه به اینکه لاکاز میتواند ABTS را در دمای اتاق (28 درجه سانتیگراد ± 2) اکسید کند، اکسیداسیون ABTS با اندازهگیری افزایش جذب در طول موج 420 نانومتر (ε) تعیین شد.۴۲۰= ۳۶۰۰۰ سانتیمتر مربع-1 M -1) با استفاده از اسپکتروفتومتر UV Agilent Carry-100. یک واحد فعالیت لاکاز برای اکسید کردن 1 میکرومول ABTS در دقیقه مورد نیاز بود. غلظت پروتئین با روش برادفورد با استفاده از آلبومین سرم گاوی به عنوان کنترل داخلی تعیین شد.۲۳،۲۴
پس از به دست آوردن آنزیم از قارچ صدفی سویه NRC 620، فعالیت آن در فواصل کشت مختلف به مدت 25 روز تحت شرایط ایستا در دمای 28 درجه سانتیگراد اندازهگیری شد.
برای بررسی تأثیر دما بر فعالیت لاکاز، آزمایشها در محدوده دمایی 20 تا 90 درجه سانتیگراد انجام شد. قبل از افزودن آنزیم و شروع واکنش، بافر (0.1 مولار سیترات سدیم، pH 4.5) و سوبسترا (ABTS) مخلوط شده و به مدت 5 دقیقه در دماهای مختلف انکوبه شدند. پایداری حرارتی آنزیم با انکوباسیون در بافر فسفات سدیم 0.05 مولار (pH 7.0) به ترتیب در دمای 40، 50، 60 و 70 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت ارزیابی شد. سپس فعالیت باقیمانده با استفاده از سوبسترای ABTS ارزیابی شد.
تأثیر pH بر فعالیت لاکاز با استفاده از ABTS به عنوان سوبسترا در بافرهای سیترات-فسفات 0.1 مولار با محدوده pH 2.5 تا 7.0 ارزیابی شد. محلول آنزیم به مدت دو ساعت در دمای 40 درجه سانتیگراد در بافرهای سیترات و تریس 0.1 مولار (pH 3، 4، 6 و 7) انکوبه شد تا پایداری pH ارزیابی شود. فعالیت باقیمانده با ABTS به عنوان سوبسترا پس از انکوباسیون محاسبه شد.
لاکاز به مدت 10 دقیقه در بافر فسفات سدیم (0.05 مولار، pH 7.0) حاوی یونهای فلزی مختلف (Mg2+، Cu2+، Co2+، Ca2+، Zn2+، K+، Na+ و Mn2+) به ترتیب در غلظتهای 2.5 میلیمولار و 10 میلیمولار انکوبه شد. سپس سوبسترا (ABTS) برای شروع واکنش اضافه شد و فعالیت نسبی ارزیابی شد.
اکسیداسیون ABTS توسط لاکاز در غلظتهای مختلف (0.025-3 میلیمولار) در pH 4.5 اندازهگیری شد تا پارامترهای سینتیکی (Vmax و Km) تعیین شود. سینتیکثابتهامقادیر معادله میکائیلیس-منتن با استفاده از نمودار لاینویور-برک محاسبه شدند، که معکوس سرعت واکنش را به عنوان تابعی از غلظت سوبسترا رسم میکند. ثابتهای سینتیکی از نمودار لاینویور-برک با استفاده از نرمافزار GraphPad Prism نسخه 6.01 محاسبه شدند.
پس از شستشوی کامل سیبها با آب لولهکشی، آنها را از وسط نصف کرده و با استفاده از آبمیوهگیری سیب تمام اتوماتیک Braun MP80 (ساخت آلمان) آبگیری کردند. آب سیب از چهار لایه پارچه توری عبور داده شد. هیچ آنزیمی به گروه کنترل اضافه نشد، در حالی که 2.0٪ لاکاز (موثرترین غلظت آزمایش شده) به آب سیب تازه تهیه شده اضافه شد و سپس به مدت دو هفته در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
اسیدیته قابل تیتراسیون (TA) و pH طبق روش بولتون و همکاران تعیین شدند.ال.27pH هر نمونه با استفاده از یک pH متر دیجیتال (JENWAY 3510 pH meter) اندازهگیری شد. اسیدیته قابل تیتراسیون (TA) بر اساس اسید مالیک با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.
که در آن V و C به ترتیب حجم (میلیلیتر) و غلظت (0.1 مول بر لیتر) محلول هیدروکسید سدیم مورد استفاده در تیتراسیون هستند. K ضریب تبدیل اسید مالیک، برابر با 0.067، و W جرم (گرم) آب سیب است.
کل مواد جامد محلول (تی دی اسمحتوای تمام نمونههای آبمیوه با استفاده از رفراکتومتر جیبی PAL-1 (ATAGO، توکیو، ژاپن) تعیین شد. پس از هر اندازهگیری، لنز نوری با آب دیونیزه شسته شد و هر نمونه آب سیب سه بار آزمایش شد. مقدار هر نمونه با میانگینگیری از سه اندازهگیری محاسبه شد. میانگین ± انحراف معیار برای هر نمونه آب سیب نیز با میانگینگیری از این نتایج محاسبه شد.
ویسکوالاستیسیته نمونههای آب سیب با استفاده از ویسکومتر چرخشی (RV، Rheotest 2، آلمان) ارزیابی شد. نمونه درون استوانه "S2" ویسکومتر قرار داده شد. ویسکوزیته ظاهری با شیب منحنی تنش برشی در مقابل نرخ برش نشان داده شد که از تنش برشی و منحنیهای مربوطه در نرخهای برشی مختلف (از 1.00 تا 437.4 s⁻¹) محاسبه شد. فرمول محاسبه ویسکوزیته ظاهری به شرح زیر است:
که در آن η ویسکوزیته ظاهری (cP)، τ تنش برشی (dyn/cm²)، γ نرخ برشی (sec⁻¹) و (τ) با استفاده از مقادیر گشتاور (α) و سیلندر (Z) با استفاده از فرمول زیر محاسبه میشود: τ = Z. α.
شاخص قهوهای شدن طبق روش Meidav و همکاران تعیین شد.ال.29یک نمونه آبمیوه 10 میلیلیتری به مدت 10 دقیقه با سرعت 2750 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. 5 میلیلیتر از محلول رویی آبمیوه با 5 میلیلیتر اتانول 95% مخلوط شد. جذب نوری مخلوط با استفاده از اسپکتروفتومتر UV شیمادزو (UV-1601 PC) در طول موج 420 نانومتر اندازهگیری شد.
محتوای فنلی کل (TPC) با استفاده از معرف Folin-Ciocalteu همانطور که توسط Boulton و همکارانش شرح داده شده است، به روش رنگسنجی تعیین شد.[27منحنی استاندارد اسید گالیک برای غلظتهای 0 تا 500 میلیگرم در لیتر رسم شد (ر²= 0.997). نتایج به صورت معادل اسید گالیک (میلیگرم GAE/mL) بیان شدهاند.
۱۲۵ میکرولیتر آب مقطر و ۲۸۵۰ میکرولیتر محلول FRAP را به ۲۵ میکرولیتر آب سیب اضافه کنید و مخلوط را به مدت ... در تاریکی قرار دهید.30دقیقه. سپس میزان جذب را در طول موج 593 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر UV شیمادزو (UV-1601 PC) اندازهگیری کنید. معرف FRAP با مخلوط کردن 300 میلیمولار بافر استات (pH 3.6)، 20 میلیمولار کلرید آهن (III) و 10 میلیمولار 2،4،6-تریس(2-پیریدیل)تریازین (TPTZ) (حل شده در 40 میلیمولار HCl) با نسبت 10:1:1 تهیه شد. منحنی استاندارد با استفاده از ترولوکس به عنوان استاندارد () رسم شد.آر²= 0.999) و نتایج به صورت μM Trolox/mL بیان میشوند.
فعالیت آنتیاکسیدانی آبمیوههای تیمار شده و تیمار نشده با استفاده از روش DPPH تعیین شد تا توانایی آنها در حذف رادیکالهای آزاد DPPH ارزیابی شود.31ده میکرولیتر از آبمیوه با ۱ میلیلیتر محلول DPPH (100 میکرومولار) در متانول مخلوط شد. پس از واکنش در تاریکی به مدت 30 دقیقه، جذب مخلوط در طول موج 517 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر UV شیمادزو (UV-1601 PC) اندازهگیری شد. نتایج بر اساس منحنی کالیبراسیون به صورت معادلهای ترولوکس (میکرومولار ترولوکس/میلیلیتر) بیان شدند (R2= 0.990).
دادههای بهدستآمده نشان داد که حداکثر تولید لاکاز در قارچهای صدفی NRC 620 تا پایان روز هجدهم تخمیر مشاهده شد و به فعالیت 1302 واحد در لیتر رسید. این امر مبنای تعیین زمان کشت بهینه برای تولید لاکاز قرار گرفت (شکل 1). اگرچه تولید آنزیم با افزایش زمان کشت افزایش یافت، اما سرعت افزایش مستقیماً با زمان کشت متناسب نبود؛ پس از 21 روز، فعالیت آنزیم تنها 90 واحد در لیتر (به 1390 واحد در لیتر) افزایش یافته بود. بنابراین، در نهایت 18 روز به عنوان زمان کشت بهینه برای ایجاد تعادل بین عملکرد محصول و مزایای اقتصادی افزایش زمان کشت انتخاب شد.
تأثیر زمان کشت بر عملکرد لاکاز در قارچ Pleurotus ostreatus NRC 620. سه بلوک میسلیومی قارچی (12 میلیمتری) در 50 میلیلیتر محیط کشت استریل تلقیح و سپس در دمای 28 درجه سانتیگراد برای زمانهای مختلف کشت داده شدند.
مطابق با سایر مطالعات، نتایج ما نشان میدهد که دوره کشت ایدهآل برای رسیدن به اوج ترشح لاکاز توسط قارچها احتمالاً بین ۷ تا ۳۶ روز است.32طبق گفتهی ایزیکه و همکاران33، *Trametes polyzona* WRF03 تا پایان روز نهم تخمیر، با فعالیت ویژه 1637 واحد بر میلیگرم پروتئین، بیشترین مقدار لاکاز را تولید کرد. علاوه بر این، عثمان و همکاران34دریافتند که *Trichoderma harzianum* S7113 مقدار زیادی لاکاز را در روز پنجم کشت ترشح میکند. میزان تولید لاکاز در روز چهاردهم به اوج فعالیت خود رسید و سپس به تدریج کاهش یافت.34اگرچه ترشح آنزیم میتواند در طول فاز اصلی رشد نیز رخ دهد، اما معمولاً در طول فاز میانی به اوج خود میرسد و با مصرف منبع کربن یا نیتروژن تحریک میشود.۳۴،۳۵
اگرچه لاکاز از Pleurotus ostreatus NRC 620 فعالیت بالایی را در طیف وسیعی از دما از 50 درجه سانتیگراد تا 80 درجه سانتیگراد نشان داد و به اوج فعالیت (69-98٪) نزدیک شد، اما حداکثر فعالیت آن در دمای 70 درجه سانتیگراد مشاهده شد (شکل 2a). در خارج از این محدوده دمایی، فعالیت آنزیم تقریباً در 70 درجه سانتیگراد کاهش یافت. این نتایج نشان میدهد که آنزیم در دماهای بالا فعال است، احتمالاً به این دلیل که دمای بالا انرژی جنبشی واکنش را افزایش میدهد.
تأثیر دمای واکنش (a) و pH (b) بر فعالیت لاکاز در *Pleurotus ostreatus* NRC 620. دماهای بین 20 تا 90 درجه سانتیگراد با پیش انکوباسیون مخلوط در دماهای مختلف به مدت 5 دقیقه قبل از افزودن آنزیم و شروع واکنش حاصل شد. تأثیر pH بر فعالیت لاکاز با استفاده از ABTS به عنوان سوبسترا در محلولهای حاوی 0.1 مولار بافر سیترات-فسفات در محدوده pH 2.5 تا 7.0 ارزیابی شد.
به گفتهی ایزیکه و همکارانال.33دمای بهینه برای لاکاز *Trametes polyzona* WRF03 55 درجه سانتیگراد است که مشابه دمای *Ganoderma lucidum* است.لاکاز۳۶و مشابه دمای بهینه (50 درجه سانتیگراد) برای *Trametes polyzona* KU-RNW02737لاکاز . بالدریان۳۸اشاره میکند که همانند سایر سیستمهای آنزیمی تجزیهکننده لیگنین، محدوده دمایی ایدهآل برای لاکاز بین ۵۰ تا ۷۰ درجه سانتیگراد است.
نتایج نشان داد که آنزیم در pH 3.0 بالاترین فعالیت را نشان میدهد و در pH 3.5 به 94٪ فعالیت میرسد. با این حال، در طیف وسیعی از pH از 2.5 تا 7.0 فعال باقی میماند (شکل 2b). علاوه بر این، در شرایط اسیدی در مقایسه با شرایط خنثی یا قلیایی فعالیت بیشتری نشان داد. فعالیت آن حداقل 77٪ در محدوده pH از 2.5 تا 4.5 باقی ماند، اما در pH 7.0 فقط به تقریباً 38٪ رسید. pH بهینه برای لاکاز از *Trametes polyzona* WRF03، 4.533 بود که مشابه pH برای لاکازهای *Trametes polyzona* KU-RNW02737، *Trichoderma harzanium* 39، *Pleurotus* sp. 40 و *Trametes hirsuta* 41 است. با این حال، طبق مطالعه Chairin و همکاران.42، pH بهینه برای لاکاز از *Polymorpha f. sp.* WR710-1 برابر با 2.2 است، در حالی که pH بهینه برای لاکاز از *Polymorpha f. sp.* IBL-04 برابر با 5.043 است. اتصال آنیونهای هیدروکسید (مهارکننده لاکاز) به اتمهای مس لاکاز T2/T3 ممکن است دلیل کاهش فعالیت لاکاز در شرایط pH خنثی یا قلیایی باشد. این امر ممکن است انتقال الکترون داخلی از مرکز T1 به مرکز T2/T3 را مختل کند، در نتیجهمحدود کردنفعالیت آنزیم23،44
با انکوباسیون آنزیم در دماهای مختلف، مشخص شد که هم زمان انکوباسیون و هم دما بر پایداری آنزیم تأثیر میگذارند. نکته قابل توجه این است که لاکاز از *Trametes polyzona* NRC 620 در دمای 40 و 50 درجه سانتیگراد پایداری بالاتری نشان داد و به ترتیب 68.33٪ و 59.61٪ از فعالیت اولیه خود را پس از 120 دقیقه حفظ کرد (شکل 3a). در مقابل، در شرایط مشابه (40 و 50 درجه سانتیگراد، 120 دقیقه)، لاکاز از *Trametes polyzona* WRF03 به ترتیب 64.38٪ و 42.92٪ از فعالیت خود را حفظ کرد.33برعکس، افزایش زمان و دمای انکوباسیون، پایداری لاکاز *Trametes polyzona* NRC 620 را کاهش داد؛ پس از انکوباسیون در دمای 60 و 70 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه، فعالیت آن به ترتیب به 39.24٪ و 1.72٪ کاهش یافت (شکل 3a). مطابق با نتایج تجربی، لاکاز *Trametes polyzona* WRF03 در طول فرآیند عملیات حرارتی، پایداری بالاتری در دمای 40 و 50 درجه سانتیگراد نشان داد.33به طور مشابه، لوئانگجارونکیت و همکارانال.37و چیرین و همکارانال.۴۲پایداری لاکازهای Trametes polyzona KURNW027 و Trametes polyzona WR710-1 را به ترتیب در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت گزارش کردند. لاکاز به عنوان یک بیوکاتالیست مفید که در زمینههای مختلف بیوتکنولوژی قابل استفاده است، باید پایداری و عملکرد خوبی در طیف وسیعی از دما داشته باشد.
پایداری ترموستاتیک (a) و پایداری pH (b) لاکاز از *Pleurotus ostreatus* NRC 620. پایداری ترموستاتیک با انکوباسیون محلول آنزیم در بافر فسفات سدیم 0.05 مولار (pH 7.0) به ترتیب در دمای 40، 50، 60 و 70 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت ارزیابی شد. پایداری pH با انکوباسیون محلول آنزیم در بافر سیترات 0.1 مولار و بافر تریس (pH 3، 4، 6 و 7) در دمای 40 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت ارزیابی شد. فعالیت باقیمانده با استفاده از ABTS به عنوان سوبسترا پس از انکوباسیون محاسبه شد.
برای تعیین شرایط بهینه برای استفاده و نگهداری آنزیم، ما تأثیر pH را بر پایداری لاکاز بررسی کردیم. قرار گرفتن در معرض مقادیر مختلف pH به طور قابل توجهی بر پایداری ساختار پروتئین تأثیر گذاشت و در نتیجه بر پایداری و فعالیت مولکول آنزیم تأثیر گذاشت. نتایج نشان داد که آنزیم در شرایط اسیدی پایداری کمتری دارد، در حالی که در مقادیر pH بالاتر (نواحی خنثی و قلیایی) پایداری بهتری نشان میدهد. در مقادیر pH 7.0، 6.0، 4.0 و 3.0، میزان حفظ آنزیم پس از 120 دقیقه به ترتیب تقریباً 100٪، 62.54٪، 52.39٪ و 11.14٪ بود (شکل 3b). *Strombus multisus* لاکاز WRF03 پایداری بالاتری در مقادیر pH خنثی (5.5-6.5) و پایداری کمتری در مقادیر pH اسیدی (زیر 4.0) نشان داد. پس از ۱۲۰ دقیقه در مقادیر pH 5.5، 6.0 و 6.5، میزان حفظ آنزیم به ترتیب تقریباً ۸۲٪، ۱۰۰٪ و ۹۳٪ بود.33خیرین و همکاران42اشاره کرد که لاکاز از Trametes polyzona WR710-1 در محدوده pH 6.0 تا 7.0 پایدار است، در حالی که سید و همکارانش45نشان داد که لاکاز در شرایط pH خنثی پایدارتر است. با این حال، لاکاز Cerrena unicolor در شرایط قلیایی (pH 9.0) نیز پایداری نشان داد.46لاکازهای مورد مطالعه پایداری بالایی در طیف وسیعی از pH نشان دادند. این میتواند یک ویژگی مهم برای کاربردهای صنعتی باشد.
از آنجایی که برخی از یونهای فلزی هم اثرات تحریکی و هم اثرات مهاری بر فعالیت آنزیم دارند، اثرات آنها بر فعالیت آنزیم باید در کاربردهای صنعتی در نظر گرفته شود. این امر بسیار مهم است زیرا یونهای فلزی آلایندههای رایج محیطی هستند که میتوانند بر پایداری و سنتز آنزیمهای خارج سلولی تأثیر بگذارند.47برای بررسی اثرات یونهای فلزی متعدد بر لاکاز از *Pleurotus ostreatus* NRC 620، آزمایشهای مربوطه را انجام دادیم. همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است، بسته به نوع فلز مورد استفاده، افزایش غلظت یون فلزی از 2.5 میلیمولار به 10 میلیمولار بر عملکرد آنزیم تأثیر منفی گذاشت. به عنوان مثال،منیزیم²⁺ , Co²⁺ , روی²⁺، ومس²⁺میتواند فعالیت آنزیم را تحریک و فعال کند، در حالی کهسدیم⁺ , منگنز²⁺ , کلسیم²⁺، وک⁺میتواند فعالیت آنزیم را مهار کند. در غلظت 10 میلیمولار، یونهای Cu²+ و Mg²+ قویترین فعالکنندههای فعالیت لاکاز از *Pleurotus ostreatus* NRC 620 بودند که به ترتیب درجه فعالسازی تقریباً 34٪ و 20٪ را فراهم میکردند. با این حال، در غلظت 10 میلیمولار، یونهای Ca²+ قویترین مهارکننده لاکاز بودند و فعالیت آنزیم را تقریباً 60٪ کاهش دادند.
اثر یونهای فلزی بر فعالیت لاکاز Pleurotus ostreatus NRC 620. لاکاز به مدت 10 دقیقه در بافر فسفات سدیم (0.05 M، pH 7.0) حاوی یونهای فلزی مختلف در غلظتهای 2.5 میلیمولار و 10 میلیمولار انکوبه شد. سپس واکنش با افزودن سوبسترا (ABTS) آغاز شد و پس از آن فعالیت نسبی اندازهگیری شد.
نتایج ما با نتایج سایر نویسندگان که دریافتند Mg²⁺ و Cu²⁺ فعالیت *Trametes polyzona* WRF033 را افزایش میدهند، مطابقت دارد. کاستانو و همکاران⁴⁸ دریافتند که لاکاز از *Xylaria* sp. تا حدودی توسط یونهای مس (Cu²⁺) تحریک میشود. علاوه بر این، Foroutanfar و همکاران⁴⁹ و Si و همکاران⁵⁰ به ترتیب مطالعات مشابهی را روی لاکاز از *Paraconiothyrium variabile* و *Trametes pubescens* انجام دادند. محل اتصال مس نوع II (T2) این آنزیم میتواند در غلظت معینی با Cu²⁺ اشباع شود، که ممکن است تحریک فعالیت لاکاز را در غلظتهای بالاتر Cu²⁺39 توضیح دهد. از آنجایی که لاکازهای قارچهای پوسیدگی سفید، اکسیدازهایی حاوی چندین اتم مس هستند، اثرات یونهای مس بر فعالیت لاکاز متنوع است و از تحریک و مهار تا خنثی متغیر است.⁵¹ در مقابل، ژو و همکارانش. [52]گزارش داد کهمس²⁺فعالیت لاکاز موریانه زیرزمینی تایوان (Odontotermes formosanus) را مهار کرد. با این حال، لاکازهای Cerena sp. HYB07[53]و کلیتوسایب ماکسیما[54]تحت تأثیر یونهای مس قرار نگرفتند.
ویژگی سوبسترا با پارامترهای سینتیکی آن (Km و Vmax) نشان داده شد؛ هرچه میل ترکیبی سوبسترا با آنزیم قویتر باشد، مقدار Km کمتر و ویژگی سوبسترا بیشتر است.۳،۲۱،۵۵پارامترهای سینتیکی (Km و Vmax) لاکاز از *Pleurotus ostreatus* NRC 620 با استفاده از نرمافزار GraphPad Prism 6.0 و با رسم نمودار Lineweaver-Burk تعیین شدند (شکل 5). هنگام استفاده از ABTS به عنوان سوبسترا، نتایج 1.99 میلیمولار و 16217 میکرومولار بودند.دقیقه⁻¹ ل⁻¹،به ترتیب. السید و همکاران.21گزارش داد که مقادیر Km برای اکسیداسیون ABTS به ترتیب 0.1 میلیمولار و 0.064 میلیمولار بود که نشاندهنده میل ترکیبی بالای ایزوآنزیمهای Lac A و Lac B برای ABTS است. علاوه بر این، مقادیر Vmax برابر با 0.182 میکرومولار بود.دقیقه⁻¹و 0.603 میکرومولدقیقه⁻¹به ترتیب. مقدار Km به دست آمده کمتر از Trametes polyzona WRF03 (8.66 میلی مولار) بود؛ علاوه بر این، مقدار Vmax آنها (1429 میلی مول در دقیقه) نیز کمتر بود.پایینترهنگام استفاده از ABTS به عنوان سوبسترا.33 به طور مشابه، مقادیر Km غلظت لاکاز Lentinus squarrosulus MR13 و Trametes sp. AH28-2 به ترتیب 0.0714 میلیمولار و 0.025 میلیمولار و مقادیر Vmax به ترتیب 0.0091 میلیمولار در دقیقه و 0.67 میلیمولار در دقیقه و میلیگرم در دقیقه (نسبت به ABTS) بود.به ترتیب.۵۶،۵۷
تأثیر غلظت ABTS بر فعالیت لاکاز از *Pleurotus ostreatus* NRC 620 بررسی شد و نمودار Lineweaver-Burk از عکس سرعت واکنش اولیه در مقابل غلظت ABTS رسم شد. واکنش اکسیداسیون ABTS با غلظتهای مختلف (0.025-3.0 میلیمولار) لاکاز در pH 4.5 اندازهگیری شد تا پارامترهای سینتیکی (Vmax و Km) تعیین شوند. ثابتهای سینتیکی Michaelis-Menten با استفاده از نمودار Lineweaver-Burk از عکس سرعت واکنش در مقابل غلظت سوبسترا محاسبه شدند. ثابتهای سینتیکی از نمودار Lineweaver-Burk با استفاده از نرمافزار GraphPad Prism 6.01 محاسبه شدند.
آنزیمهای شفافکننده سنتی، مانند پکتینازها، مواد پکتیکی را هیدرولیز میکنند و ویسکوزیته و کدورت را کاهش میدهند. آنها به طور مؤثر پلیساکاریدهای ساختاری را تجزیه میکنند و اغلب در ترکیب با سایر آنزیمها، مانند سلولازها و همیسلولازها، برای بهبود بازده و شفافیت استفاده میشوند. با این حال، پکتینازها به طور خاص ترکیبات فنلی را هدف قرار نمیدهند، که عوامل اصلی کدورت و قهوهای شدن اکسیداتیو، به ویژه در آبمیوههایی مانند آب سیب و انگور هستند.58در مقابل، لاکازها اکسیداسیون ترکیبات فنلی را کاتالیز میکنند و آنها را به مولکولهای بزرگتر و نامحلول پلیمریزه میکنند که میتوانند با رسوبگذاری یا فیلتراسیون حذف شوند. این مکانیسم نه تنها شفافیت را بهبود میبخشد، بلکه با کاهش احتمال قهوهای شدن اکسیداتیو ناشی از ترکیبات فنلی، ماندگاری آبمیوه را نیز افزایش میدهد. علاوه بر این، فرآیندهای شفافسازی مبتنی بر لاکاز را میتوان تحت شرایط فرآوری ملایم (pH 3.5-5.5، دمای 25-40 درجه سانتیگراد) انجام داد و آنها را برای آبمیوههای حساس بدون به خطر انداختن خواص تغذیهای یا حسی آنها مناسب کرد.59مطالعات نشان دادهاند که تصفیه با پکتیناز میتواند آبمیوه را در عرض ۱ تا ۲ ساعت شفاف کند، در حالی که تصفیه با لاکاز معمولاً به زمان واکنش طولانیتری (۳ تا ۶ ساعت) نیاز دارد تا ترکیبات فنلی را به طور کامل کاهش دهد. با این حال، این فرآیند را میتوان با بیحرکت کردن آنزیم یا با ترکیب لاکاز با روشهای شفافسازی مکانیکی بهینه کرد.60در این مطالعه، پروفایل آنزیمی عصاره خام، فعالیتهای قابل توجه لاکاز و آلفا-آمیلاز را نشان داد، در حالی که فعالیتهای پکتیناز و زایلاناز بسیار پایین بود و فعالیت سلولاز شناسایی نشد. بنابراین، کاهش کدورت و محتوای فنلی عمدتاً به دلیل عملکرد لاکاز بود، در حالی که تغییر در ویسکوزیته میتواند تا حدی به دلیل عملکرد آمیلاز باشد.
جدول 1 پارامترهای فیزیکوشیمیایی آب سیب تازه گرفته شده و نمونههای تیمار شده با لاکاز را نشان میدهد. نتایج نشان داد که بازده آب سیب تازه گرفته شده (71.59٪) کمتر از نمونههای تیمار شده با لاکاز (87.34٪) بود. این نتایج با یافتههای پیلنیک و اورنج مطابقت دارد.61که نشان داد استفاده از آنزیمها در فرآوری میوه میتواند عملکرد آبمیوه را افزایش دهد، فیلتراسیون را بهبود بخشد و آبمیوه شفاف و با کیفیتی را برای تغلیظ به دست آورد. افزایش عملکرد آبمیوه عمدتاً به دلیل افزایش محتوای قندهای محلول در آبمیوه است. در طول هیدرولیز آنزیمی میوهها، مزوگلیا و پکتین موجود در دیوارههای سلولی محصول از بین رفته و به مواد محلول مانند قندهای خنثی و اسیدها تبدیل میشوند.۶۲.مقدار pH آب سیب تیمار شده با آنزیم به طور قابل توجهی کمتر از گروه کنترل بود (P < 0.05) و مقدار pH هر دو گروه در طول نگهداری به طور قابل توجهی افزایش یافت (جدول 1). این نتایج با نتایج مارک و همکاران مطابقت دارد.63که اشاره کرد pH آب میوه بادام هندی پس از نگهداری پس از عملیات حرارتی کاهش یافته است. تخریب پکتین و تشکیل اسید گالاکتورونیک پس از عملیات آنزیمی ممکن است مسئول افزایش pH در طول نگهداری باشد. pH نمونههای تیمار شده با آنزیم در طول نگهداری بین ۴.۰۵ تا ۴.۳۱ باقی ماند، در حالی که pH آب سیب تیمار نشده بین ۴.۱۲ تا ۴.۳۳ بود.
اسیدیته کل (TA) هر دو نمونه تیمار نشده و تیمار شده با لاکاز با افزایش زمان نگهداری روند کاهشی نشان داد (جدول 1). کاهش اسیدیته به تبدیل اسیدهای آلی به کربوهیدراتها یا واکنشهای آنزیمی و همچنین اکسیداسیون در طول نگهداری آبمیوه نسبت داده شد.64اسیدیته کل آب سیب شاهد و نمونههای تیمار شده با آنزیم کمتر از سایر آبمیوهها (آب توتفرنگی ۰.۹٪، آب آلو ۲.۲٪، آب کامکوات ۱.۰٪، آب زردآلو ۲.۴٪، آب پرتقال ۰.۸٪) بود، اما مشابه سایر آبمیوهها (مثلاً آب گلابی ۰.۳٪) بود.62این تفاوتها در آب سیب تازه فشرده شده تصفیه نشده ممکن است به دلیل عوامل مختلفی مانند شرایط رشد، عوامل ژنتیکی، سطح بلوغ و روشهای فرآوری باشد.65کاهش اسیدیته کل آب سیب کنترل و آب سیب تیمار شده با لاکاز با نتایج ارائه شده توسط سینگ و همکاران (2007) مطابقت دارد.66در مورد کاهش اسیدیته کل آب سیب جین نو پس از 74 روز نگهداری. از سوی دیگر، اوشمیانسکی و وجدیلو67هنگام مطالعه تأثیر روشهای سنتی شفافسازی، هیچ تغییر معنیداری در اسیدیته آب سیب مشاهده نشد.
نتایج ارائه شده در جدول 1 نشان میدهد که مقدار کل مواد جامد محلول (TSS) آب سیب تیمار شده با لاکاز بیشتر از نمونه تیمار نشده بود. این نتایج با مطالعات منتشر شده مطابقت دارد..۶۸علاوه بر این، جدول 1 نشان میدهد که مقدار TSS گروه کنترل آب سیب در زمان اولیه 9.58 بود و تا پایان دوره نگهداری به 11.05 رسید. این مقادیر کمتر از مقادیر TSS آب سیب تازه گزارش شده توسط حمید و همکارانش است.۶۹(به ترتیب 11.2 و 11.80). مقدار TSS نمونههای آب سیب تیمار شده با لاکاز به طور قابل توجهی افزایش یافت، از 11.23 شروع شد و پس از دو هفته نگهداری در دمای 4 درجه سانتیگراد به 12.93 رسید (جدول 1). افزایش مشابهی در TSS در طول نگهداری در مرکبات، لیمو و پرتقال شیرین نیز مشاهده شد. افزایش کل مواد جامد محلول (TSS) در طول نگهداری ممکن است به دلیل هیدرولیز پلیساکاریدها (نشاسته) به مونوساکاریدها (قندها)، افزایش غلظت ناشی از آبگیری آب میوه و تجزیه پکتین موجود در آب میوه به مواد جامد محلول باشد. افزایش کل مواد جامد محلول (TSS) احتمالاً به دلیل افزایش قندهای محلول است که ممکن است به ترتیب توسط تبدیل پکتین یا سلولز به قندهای محلول توسط پکتین یا سلولاز یا توسط هیدرولیز نشاسته به قندها تشکیل شوند، همانطور که توسط حامد و همکاران گزارش شده است.۶۹. (یا: ۶۹.)تأثیر لاکاز بر خواص آب سیب را میتوان به صورت بصری مشاهده کرد، زیرا آب سیب تیمار شده با لاکاز، جریانپذیری بهتر و ویسکوزیته کمتری نسبت به آب سیب تیمار نشده نشان میدهد. این مشاهده در جدول 1 ثبت شده است؛ ویسکوزیته نمونه تیمار شده با آنزیم 1.87 سانتیپواز بود، در حالی که ویسکوزیته نمونه کنترل 2.95 سانتیپواز بود. این کاهش قابل توجه در ویسکوزیته احتمالاً به دلیل ظرفیت بالاتر نگهداری آب مواد شبه پکتینی و تشکیل ساختار شبکهای منسجم است.
در این مطالعه، اثر لاکاز بر شاخص قهوهای شدن (BI) آب سیب با اندازهگیری جذب در طول موج 420 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر بررسی شد. نتایج در جدول 1 نشان داده شده است. در طول مدت نگهداری، شاخص قهوهای شدن نمونههای آب سیب در هر دو گروه تیمار شده و تیمار نشده، روند افزایشی تدریجی را نشان داد. BI نشان دهنده درجه قهوهای شدن است و میتواند به عنوان ...یک نکته مهمشاخص واکنشهای قهوهای شدن آنزیمی و غیرآنزیمی. جذب در طول نگهداری به طور قابل توجهی افزایش یافت (P < 0.05). در پایان نگهداری،آ۴۲۰مقدار قهوهای شدن نمونههای آب سیب در گروههای کنترل و تیمار شده با آنزیم به ترتیب حدود 217٪ و 121٪ افزایش یافت (جدول 1). نتایج نشان میدهد که تیمار آنزیمی میتواند به طور مؤثر درجه قهوهای شدن را حدود 56٪ کاهش دهد. نتایج Bezerra و همکاران.[19] با نتایج ما مطابقت دارند؛ آنها از لاکاز-گلوتارآلدئید-فیبر نارگیل برای شفافسازی آب سیب استفاده کردند و رنگ اصلی آن را ۶۱٪ کاهش دادند.
اگرچه پلیفنولهای موجود در آبمیوهها اثرات تغذیهای و درمانی مثبتی بر بدن انسان دارند، اما میتوانند با پروتئینها نیز واکنش نشان دهند و باعث کدر شدن، رسوب یا تیرگی آبمیوه شوند و در نتیجه طعم و عطر محصول را تغییر داده و ماندگاری آن را کاهش دهند.71هدف از این مطالعه، کاهش ایمن محتوای ترکیبات فنلی آب سیب با استفاده از لاکاز حاصل از قارچ Pleurotus ostreatus NRC 620 بود. نتایج ارائه شده در جدول 1 نشان میدهد که محتوای کل ترکیبات فنلی آب سیب تیمار شده با لاکاز قبل از نگهداری در دمای 4 درجه سانتیگراد به طور قابل توجهی کاهش یافته است. علاوه بر این، محتوای کل ترکیبات فنلی نیز در طول نگهداری در هر دو نمونه مورد مطالعه کاهش یافته است (جدول 1). تحقیق توسط ساندری و همکاران.72نشان داد که آب سیب تیمار شده با آنزیم میتواند فعالیت آنتیاکسیدانی و محتوای ترکیبات فنلی خود را حفظ کند. با این حال، نتایج مطالعهای توسط Lettera و همکاران.73نشان میدهد که تیمار آب پرتقال با لاکاز قارچی میتواند محتوای ترکیبات فنلی موجود در آن را تا ۴۵٪ کاهش دهد.
نشان داده شده است که ترکیبات فنلی دارای خواصی مانند مهار رادیکالهای آزاد، کاهش و خاموش کردن اکسیژن تکی، انتقال اتم هیدروژن و اهدای الکترون به رادیکالهای آزاد هستند که آنها را به آنتیاکسیدانهای قوی تبدیل میکند.74بنابراین، در این مطالعه، از روشهای مبتنی بر DPPH و FRAP برای ارزیابی تأثیر لاکاز بر فعالیت آنتیاکسیدانی آب سیب نگهداری شده در یخچال به مدت 14 روز استفاده شد (جدول 2). هر دو روش افزایش فعالیت آنتیاکسیدانی را در طول نگهداری نشان دادند که ممکن است به دلیل افزایش ترکیبات فنلی آزاد یا تشکیل محصولات واکنش میلارد (MRPs) باشد، و احتمالاً محصولات واکنش میلارد علت افزایش فعالیت آنتیاکسیدانی هستند.75واکنشهای قهوهای شدن غیرآنزیمی (شامل تخریب اسید آسکوربیک، واکنشهای میلارد و تخریب قندها با کاتالیز اسیدی) رنگدانههای قهوهای (ملانوئیدینها) تولید میکنند. محصولات میانی تخریب اسید آسکوربیک و محصولات تخریب قند (مانند ترکیبات کربونیل) میتوانند از طریق واکنشهای میلارد با اسیدهای آمینه واکنش دهند.76اگرچه قهوهای شدن میوهها و سبزیجات در طول نگهداری به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است، اما درک ما از این واکنشها همچنان محدود است.77در مقایسه با روش FRAP، آب سیب تیمار شده با لاکاز فعالیت آنتیاکسیدانی به طور قابل توجهی پایینتری را با روش DPPH نشان داد (جدول 2) و فعالیت آنتیاکسیدانی همه نمونهها با افزایش زمان نگهداری به طور قابل توجهی افزایش یافت. در این مطالعه از دو روش مختلف برای تعیین فعالیت آنتیاکسیدانی استفاده شد زیرا اصول آنها متفاوت است. روش DPPH توانایی خنثیسازی رادیکالهای آزاد را اندازهگیری میکند، در حالی که روش FRAP توانایی کاهش یونهای آهن را اندازهگیری میکند. بنابراین، توصیه میشود از چندین روش برای تعیین فعالیت آنتیاکسیدانی استفاده شود تا فعالیت آنتیاکسیدانی نمونههای مورد مطالعه بهتر درک شود.78
یکی از یافتههای کلیدی این مطالعه این است که لاکاز *Pleurotus ostreatus* NRC 620 فعالیت بهینهای در دمای 70 درجه سانتیگراد و pH 3.0 از خود نشان میدهد. در مقایسه با سایر لاکازهای قارچی که معمولاً برای شفافسازی آبمیوه استفاده میشوند، مانند لاکازهای *Trametes versicolor* و *Ganoderma lucidum*، *P. ostreatus* NRC 620 پایداری حرارتی بالاتر و pH اسیدیتری را نشان میدهد. لاکازهای *Trametes versicolor* و *Ganoderma lucidum* معمولاً فعالیت بهینهای را در محدوده 50-60 درجه سانتیگراد و در pH بین 3.5 تا 5.0 نشان میدهند. این تفاوت ممکن است به بهبود راندمان شفافسازی آبمیوه، به ویژه برای آبمیوههای اسیدی که پایداری در pH پایینتر بسیار مهم است، کمک کند. ویژگی منحصر به فرد *P. در مقایسه با سایر لاکازهای قارچی مورد مطالعه، *Pleurotus ostreatus* NRC 620 توانایی عملکرد مؤثر در شرایط چالشبرانگیزتر را نشان میدهد. دمای فعالیت بهینه بالاتر آن، مزایای بالقوهای را در کاربردهای صنعتی، مانند سرعت واکنش سریعتر و کاهش آلودگی میکروبی، نشان میدهد. pH پایین آن، که با ماهیت اسیدی بسیاری از آبمیوهها سازگار است، ممکن است در فرآیندهای شفافسازی آبمیوه مفید باشد. این نتایج، کاوش بیشتر برای کاربرد در مقیاس بزرگ را توجیه میکند و *Pleurotus ostreatus* NRC 620 را به جایگزینی مناسب برای منابع لاکاز قارچی سنتی تبدیل میکند. در مقایسه با مطالعات قبلی، دریافتیم که دمای بهینه 60 درجه سانتیگراد و pH بهینه 3.0 است. پس از واکنش در دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 80 دقیقه، لاکاز *Ganoderma lucidum* حفظ شد.46درصد از فعالیت آن.79 طبق گفته کورنیاواتی و نیسل80آنزیمهای *Ganoderma lucidum* در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد و مقادیر pH بین ۵.۰ تا ۸.۰، پایداری عالی تا متوسطی از خود نشان میدهند و در pH 6.0 و دماهای بین ۱۰ تا ۳۰ درجه سانتیگراد نیز پایداری خوبی دارند. در این مطالعه، دریافتیم که pH و دمای بهینه برای فعالیت آنزیم *Pleurotus ostreatus* به ترتیب ۳.۰ و ۷۰ درجه سانتیگراد است. پس از انکوباسیون در دمای ۴۰ درجه سانتیگراد و ۵۰ درجه سانتیگراد به مدت دو ساعت، آنزیم به ترتیب ۶۸.۳۳٪ و ۵۹.۶۱٪ از فعالیت خود را حفظ کرد. علاوه بر این، لاکاز NRC 620 قارچ Pleurotus ostreatus فعالیت بالایی را در طیف وسیعی از دما از ۵۰ درجه سانتیگراد تا ۸۰ درجه سانتیگراد نشان داد و تقریباً به حداکثر فعالیت (۶۹٪ تا ۹۸٪) رسید و حداکثر فعالیت در دمای ۷۰ درجه سانتیگراد مشاهده شد.
در نتیجه، لاکاز قارچ صدفی NRC620 که تحت شرایط استاتیک به دست آمد، فعالیت و پایداری بهینهای را در طیف وسیعی از شرایط pH و دما نشان داد و در مقایسه با سایر منابع آنزیمی، پایداری بالاتری را نشان داد. افزودن 10 میلیمولار MgSO₄ و CuSO₄ فعالیت آنزیم را به ترتیب تقریباً 21٪ و 35٪ افزایش داد. هنگامی که آنزیم به آب سیب تبدیل شد، pH و ویسکوزیته را کاهش داد، در حالی که محتوای فنلی در طول نگهداری فقط کمی کاهش یافت.
نتایج، پتانسیل لاکاز را در صنعت غذا، به ویژه در شفافسازی نوشیدنیها، تأیید میکند. لاکاز با تجزیه اختصاصی ترکیبات فنلی، نه تنها کدورت را کاهش داده و شفافیت را بهبود میبخشد، بلکه کیفیت آبمیوهها را نیز در شرایط عملیاتی ملایم حفظ میکند. برخلاف عوامل شفافکننده سنتی مانند ژلاتین، بنتونیت و ژل سیلیکا، لاکاز زباله تولید نمیکند یا عطرهای دلپذیر را از نوشیدنیها حذف نمیکند، و آن را به گزینهای سازگارتر با محیط زیست و پایدارتر تبدیل میکند. علاوه بر این، در مقایسه با سایر آنزیمها و روشهای فیلتراسیون، لاکاز یک راهحل هدفمند و مقرونبهصرفه بدون به خطر انداختن کیفیت محصول ارائه میدهد.
کیوموهیمبو، اچدی و برینک، اچجی. کاربردها و استراتژیهای تثبیت لاکازهای حاوی مس؛ مروری. Heliyon 9, e13156 (2023).
زمان ارسال: ۱۵ دسامبر ۲۰۲۵